La bioimpresión 3D hace realidad la imitación de la matriz

No hay nada virtual en los tejidos creados mediante bioingeniería, así que tome la pastilla roja y la pastilla azul

En el laboratorio de la Universidad de Florida dirigido por Christine E. Schmidt, PhD, los científicos han utilizado un método basado en la apoptosis para descelularizar los pulmones de ratas y preservar la matriz extracelular (ECM). Los científicos pretenden recelularizar los hidrogeles de ECM para crear modelos de enfermedad pulmonar. Esta proyección en 3D muestra células epiteliales de pulmón de rata cultivadas en hidrogeles de ECM de pulmón (verde: células vivas; rojo: células muertas).

La matriz extracelular (MEC) es una red tridimensional (3D) de macromoléculas (como colágeno, enzimas y glicoproteínas) que es esencial para la orientación espacial, la interacción y la señalización entre las células circundantes. Cuando se diseña la ECM, la idea es imitar los entornos naturales de los tejidos y obtener conocimientos sobre la regulación celular impulsada por la matriz y, además, desarrollar reemplazos para los órganos dañados.

La imitación de ECM cobra vida mediante la bioimpresión 3D. Una extensión de la impresión 3D tradicional, la bioimpresión 3D es una tecnología de fabricación aditiva que deposita biomateriales (células, factores de crecimiento y componentes de andamiaje reticulables) en disposiciones favorables para la formación de estructuras similares a tejidos. La bioimpresión 3D está surgiendo como una herramienta poderosa para la medicina regenerativa porque es capaz de combinar propiedades físicas y bioquímicas óptimas para la adhesión celular, la migración, la proliferación y la diferenciación.

Los modelos bioimpresos en 3D ocupan un nicho único en la comunidad de investigación, ya que ofrecen una integración estrechamente controlada de la matriz de soporte con tipos de células relevantes. "Si [quisiéramos] crear un vaso sanguíneo sintético, sembraríamos células endoteliales en una de las biotintas altamente biocompatibles, derivadas de gelatina, fibrina, alginato u otros materiales naturales", dice Akhilesh K. Gaharwar, PhD, asociado profesor de ingeniería biomédica en la Universidad Texas A&M.

El estrecho colaborador de Gaharwar, Abhishek Jain, PhD, profesor asistente de ingeniería biomédica en Texas A&M, refuerza este punto: “La bioimpresión 3D podría reproducir con precisión la anatomía vascular de un paciente, incluidas geometrías personalizadas a partir de tomografías computarizadas. Al colocar en capas una matriz polimérica y comunidades celulares, aumentamos gradualmente la complejidad del sistema, lo que hace que las células se alineen, interactúen y respondan de una manera fisiológicamente relevante”.

Gaharwar y Jain creen que modelar el complejo sistema vascular podría conducir a mejores tratamientos de las enfermedades vasculares. Se espera que las enfermedades vasculares, que causan más de 17 millones de muertes al año, alcancen proporciones epidémicas en un futuro próximo.

Un sistema vascular complejo es difícil de reproducir in vitro porque consta de una arquitectura de células de varias capas. Esta arquitectura no sólo está en consonancia con las estructuras vasculares básicas (vasos compuestos por capas internas y externas de células), sino que también respalda las intrincadas interacciones que ocurren entre las células vasculares y el microambiente circundante.

"La bioimpresión 3D es capaz de fabricar un modelo que puede replicar propiedades mecánicas, como la relajación y contracción de las paredes, así como propiedades fisiológicas, como la activación endotelial, la formación de coágulos y otras características importantes de la enfermedad", añade Jain. "Nuestros laboratorios están trabajando en una nueva familia de biotintas que conservan una alta fidelidad de forma después de la extrusión y estabilidad mecánica después de la reticulación".

La reticulación da como resultado un hidrogel, y el hidrogel se combina con nanopartículas de nanosilicato en forma de disco, que añaden resistencia a la construcción impresa y se unen electrostáticamente a los polímeros cargados. La incorporación de nanosilicatos en hidrogeles mejora notablemente las propiedades de flujo de las soluciones precursoras del producto impreso. En consecuencia, la reticulación de precursores impresos con luz ultravioleta produce una matriz excepcionalmente fuerte pero elástica, adecuada para procedimientos de injerto.1

"Nuestro objetivo es acelerar el descubrimiento de fármacos mediante la creación de un vaso sanguíneo completamente funcional con células vasculares humanas primarias", declara Gaharwar. "[Esperamos] explorar la comunicación intercelular durante los procesos patológicos a un nivel sin precedentes".

Se están desarrollando componentes básicos para tejidos de bioingeniería en la Universidad de Illinois en Chicago, en un laboratorio dirigido por Eben Alsberg, PhD, Richard y Loan Hill, profesor de bioingeniería y ortopedia, en colaboración con Oju Jeon, PhD, profesor de investigación de bioingeniería. Los componentes básicos son hidrogeles a microescala, o microgeles, y pueden incorporar diferentes tipos de células y/o factores bioactivos. Están diseñados para permitir el montaje ascendente de estructuras complejas tipo LEGO.2

Para desarrollar la arquitectura deseada, los microgeles se imprimen en ubicaciones predefinidas en un baño de suspensión de gelatina. La suspensión de gelatina ayuda a estabilizar las posiciones de los microgeles incrustados. A continuación, los microgeles se reticulan utilizando luz. Cuando la suspensión se derrite, la construcción de microgel fotoentrecruzado permanece intacta; es decir, conserva su geometría impresa original. La técnica de impresión en baño de suspensión, que se denomina incrustación reversible de forma libre de hidrogeles suspendidos (FRESH), fue desarrollada por Adam W. Feinberg, PhD, profesor de ciencia e ingeniería de materiales e ingeniería biomédica en la Universidad Carnegie Mellon.

"Empleamos FRESH para respaldar el ensamblaje de microgeles de alginato reticulados iónicamente que, además, se fotoreticulan después de formar las arquitecturas deseadas", explica Alsberg. “Demostramos que los microgeles, sembrados con células madre, podían congelarse para su almacenamiento a largo plazo y luego descongelarse más adelante manteniendo la viabilidad celular.

"Los microgeles criopreservados podrían llevarse al quirófano, descongelarse brevemente y luego imprimirse en el acto", continúa. "Con el tiempo, el material del microgel se degradaría a medida que el tejido recién desarrollado llenaba el área lesionada".

Las características plug-and-play de la biotinta de microgel son particularmente ventajosas para la generación de estructuras complejas, como vasos sanguíneos o interfaces hueso-cartílago. El equipo está realizando más avances en la impresión puramente celular, con la esperanza de recrear parcialmente los procesos de autoensamblaje celular presentes durante el desarrollo y la curación.

"Esto sería ventajoso, por ejemplo, en aplicaciones de reparación de cartílago, donde se sabe que las células se agregan de forma natural durante la condrogénesis temprana", sugiere Alsberg. “La condensación celular desempeña un papel fundamental en la creación de un microambiente adecuado para la diferenciación condrogénica de las células madre mesenquimales. Creemos que eliminar las barreras físicas de biomateriales entre las células en una construcción bioimpresa en 3D es un paradigma completamente nuevo en este campo”.3

Los microambientes físicos, químicos y biológicos tienen un efecto directo sobre el comportamiento celular. "Postulamos que las propiedades mecánicas y espaciales de los andamios impresos en 3D podrían influir significativamente en la agregación o morfología celular", dice Stephen J. Florczyk, PhD, profesor asistente de ciencia e ingeniería de materiales en la Universidad de Florida Central. "Los procesos de impresión 3D generan superficies bastante lisas". Estas superficies son lo suficientemente planas (aproximadamente 2D a nivel celular) como para instigar distintos comportamientos celulares. Según Florczyk, las células se distribuyen sobre superficies planas de forma completamente diferente a como lo hacen sobre superficies tridimensionales porosas.

Florczyk y sus colegas notaron que en las matrices comerciales de policaprolactona impresas en 3D, los únicos poros son los macroporos que carecen de las características estructurales finas necesarias para soportar las interacciones matriz-célula. El equipo se propuso recrear la porosidad en andamios artificiales combinando creativamente dos técnicas bien conocidas: FRESH (descrita anteriormente) y congelación.

La liofilización, también conocida como liofilización o creación de plantillas con hielo, todavía está emergiendo en la bioimpresión, pero es un método establecido en la industria, donde se utiliza para fabricar materiales porosos. La congelación por congelación forma cristales de hielo dentro de un material moldeado. La sublimación del hielo con liofilización deja poros aproximadamente del tamaño de los cristales de hielo anteriores.

Se han desarrollado varios métodos para ejercer control sobre las micro y macroestructuras finales de los andamios congelados. Aprovechando su conocimiento de estos métodos, Florczyk y sus colegas desarrollaron la técnica Freeze-FRESH (FF), donde los andamios de ECM se imprimen en una suspensión de gelatina y se congelan para formar poros dentro de puntales impresos.

El equipo de Florczyk analizó meticulosamente las propiedades de los materiales de los andamios FF. Luego, los científicos compararon estas propiedades con las de las biomatrices bioimpresas convencionalmente, liofilizadas y disponibles comercialmente. Los científicos observaron que los andamios FF desarrollaron micro y macroporos, alcanzando más de 10 veces la porosidad del puntal de los alginatos bioimpresos convencionalmente.

"Sorprendentemente, el proceso de congelación también aumentó la resiliencia de los andamios de FF resultantes", señala Florczyk. "Prevemos que cuando se mezclen con aditivos como la cerámica, los materiales FF podrían moldearse en diversas estructuras óseas con propiedades mecánicas cercanas a las del hueso".

Sin embargo, el equipo actualmente está investigando otra aplicación: el modelado del microambiente tumoral. Analizar las señales del microambiente tumoral de forma controlada es un desafío, pero es esencial para comprender la metástasis y la progresión de la enfermedad. La MEC impregna el tumor, proporcionando integridad estructural y señalización bioquímica.

El equipo ya ha recopilado datos preliminares que revelan una mayor proliferación y agrupación de células en matrices FF. El equipo cree que los andamios de FF podrían manipularse con precisión para parecerse a un microambiente tumoral heterogéneo.

"Una gran parte de la industria de biomateriales se centra en el uso de polímeros dentales, principalmente en la fabricación de dentaduras postizas", dice Praveen R. Arany, PhD, profesor asistente de biología oral e ingeniería biomédica en la Universidad de Buffalo. “La odontología siempre ha estado a la vanguardia del uso clínico de materiales sintéticos. Además, la odontología en el consultorio realmente ha madurado, permitiendo la fabricación personalizada de restauraciones a base de polímeros en tan solo unas horas”.

Según Arany, en un futuro próximo, las técnicas sustractivas (o de fresado) 3D para crear prótesis probablemente se verán mejoradas por tecnologías aditivas, como las dentaduras postizas impresas. Una ventaja única de las técnicas aditivas es la capacidad de funcionalizar el material impreso. Mientras que la bioimpresión de tejidos incorpora células al material de la matriz, la impresión de aparatos dentales podría incorporar productos químicos (colores) o medicamentos (antibióticos y biológicos).

El laboratorio de Arany ha explorado la posibilidad de fabricar dentaduras postizas impresas en 3D que encapsulan un agente antifúngico, la anfotericina B. Las infecciones por Candida asociadas a las dentaduras postizas afectan a más del 65% de la población que usa dentaduras postizas.4 La colonización de las dentaduras postizas por biopelículas fúngicas y bacterianas es notoriamente difícil de detectar. eliminar, ya que los organismos se incrustan en la capa exterior de material de polimetilmetacrilato (PMMA).

“Elegimos emular un paradigma bien conocido de stents liberadores de fármacos”, recuerda Arany. "Nuestros resultados demostraron que si se incorporan microesferas de antibióticos en la capa exterior de las dentaduras postizas impresas, el fármaco se libera continuamente a medida que el material de la superficie se degrada".

Para desarrollar una tecnología de microesferas de antibióticos con potencial clínico, el laboratorio de Arany optimizó las concentraciones de fármacos encapsulados en microesferas y las densidades de las microesferas. Las dentaduras postizas antimicóticas son el enfoque inicial de OptiMed Technology, una nueva empresa de biotecnología derivada del laboratorio universitario de Arany y con sede en Buffalo, Nueva York. El equipo de OptiMed ya está estudiando otras aplicaciones.

“La saliva es un fluido corporal bastante infravalorado”, señala Arany. “A medida que surgen ciertos problemas de salud, las moléculas vinculadas a estas enfermedades pasan del suero a la saliva. Los aparatos dentales impresos en 3D están en una posición única para respaldar el diagnóstico salival. Imagínese si su dentadura postiza pudiera medir el nivel de glucosa y enviar datos al médico tratante”.

Además, los biomateriales de detección y respuesta podrían contribuir tanto al diagnóstico como al tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, dichos materiales podrían diseñarse para liberar medicamentos a pedido. A medida que se produce la infección, el pH de la superficie de la dentadura postiza cambiaría, lo que despertaría que los materiales dentales funcionalizados "inteligentes" iniciaran la liberación del fármaco. Arany imagina una selección de cargas biológicas que responden a estímulos en implantes dentales, ligaduras quirúrgicas e incluso instrumentos dentales.

Los tejidos descelularizados están incursionando en una variedad de aplicaciones de salud al proporcionar andamios para la regeneración de tejidos. Los injertos acelulares reducen la necesidad de recolectar tejido autólogo del paciente y minimizan las posibilidades de rechazo inmunológico.

Cuando se descelulariza un tejido, las células que habitan en la MEC se eliminan mientras se preserva la propia MEC. "Nuestro laboratorio fue uno de los primeros en informar sobre una técnica basada en la apoptosis para la eliminación de células", afirma Young Hye Song, PhD, científica principal del laboratorio de la Universidad de Florida dirigido por Christine E. Schmidt, PhD, profesora y presidenta de la familia Pruitt. del departamento de ingeniería biomédica. Song sugiere que el método del laboratorio Schmidt elimina las células con más suavidad que una alternativa común, el uso de detergentes fuertes. Según Song, se sabe que los detergentes fuertes alteran la estructura del tejido y podrían disminuir el potencial regenerativo de los injertos.

El equipo trata tejidos con camptotecina, una citotoxina común que se sabe que induce la apoptosis en las células. Luego, el equipo limpia los desechos con tampones hipertónicos e isotónicos suaves.

El laboratorio Schmidt informa que logró un éxito significativo en la descelularización de las estructuras del tejido nervioso y pulmonar, mostrando la preservación del contenido de colágeno o glucosaminoglicano. Song explica que aún se está explorando la composición exacta de ECM. En consecuencia, la ECM es bastante difícil de reproducir mezclando componentes individuales.

"En el futuro", aventura Song, "el análisis molecular detallado de la ECM descelularizada podría acercarnos a la creación de mezclas de ECM para aplicaciones de medicina personalizada". El objetivo final es obtener una solución inyectable de tejido de injerto acelular mediante la digestión de la ECM con preparaciones ácido-enzimáticas.

La cirugía de implantación del injerto es un procedimiento complejo y requiere la escisión de tejido sano para una integración óptima del injerto. Las formulaciones inyectables, por otro lado, pueden ofrecer una opción menos invasiva para unir lesiones tisulares. La microscopía electrónica de barrido reveló que, en condiciones fisiológicas, los hidrogeles de ECM forman fibras de aproximadamente 100 nm de diámetro. El gel podría inyectarse directamente en organismos vivos para crear estructuras para el crecimiento de tejidos.

"Nuestras direcciones futuras en la investigación pulmonar incluyen la recelularización de hidrogeles con células epiteliales vasculares y de las vías respiratorias", ofrece Song. "Podríamos recrear microambientes comunes a enfermedades pulmonares como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y desarrollar terapias efectivas sin necesidad de trasplante de pulmón".

Referencias1. Gold K, Gaharwar AK, Jain A. Tendencias emergentes en el modelado multiescala de la fisiopatología vascular: órgano en un chip e impresión 3D. Biomateriales 2019; 196: 2–17. 2. Jeon O, Lee YB, Hinton TJ, Feinberg AW, Alsberg E. Biotinta de microgel de alginato cargado de células criopreservadas para la bioimpresión 3D de tejidos vivos. Madre. Hoy química. 2019; 12: 61–70,3. Jeon O, Lee YB, Jeong H, Lee SJ, Alsberg E. Biotinta de células vivas y medio de soporte fotocurable para impresión y generación de tejidos diseñados con geometrías complejas. bioRxiv 2019.4. Nagrath M, Sikora A, Graca J, Chinnici JL, Rahman SU, Reddy SG, Ponnusamy S, Maddi A, Arany PR. Interfaces protésicas funcionalizadas mediante impresión 3D: generación de prótesis neutralizadoras de infecciones en odontología. Madre. Hoy Común. 2018; 15: 114-119.

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