La señalización redox induce la proteína ribosomal del receptor de laminina

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 7742 (2022) Citar este artículo

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Los biomateriales actuales reemplazan eficazmente las estructuras biológicas, pero están limitados por infecciones y fallas de materiales a largo plazo. Este estudio examinó los mecanismos moleculares de los tratamientos de descarga luminosa de radiofrecuencia (RFGDT) para mediar en la desinfección de superficies de biomateriales y, al mismo tiempo, promover la unión y proliferación celular. Los biomateriales dentales se sometieron a RFGDT y se evaluó la viabilidad de especies microbianas orales, a saber, Streptococcus mutantes (SM), Streptococcus gordonii (SG), Moraxella catarrhalis (MC) y Porphyromonas gingivalis (PG). Se examinó la unión celular y la supervivencia de una línea celular de preodontoblastos, MDPC-23. Finalmente, se investigaron investigaciones mecanicistas sobre la generación redox y la señalización biológica. Según sus composiciones, los biomateriales dentales indujeron especies reactivas de oxígeno (ROS) después de RFGDT dependiente de la dosis. La viabilidad microbiana reducida fue evidente después de RFGDT en las especies catalasa negativas (SM y SG) de manera más prominente que en las especies catalasa positivas (MC y PG). Los ensayos de adhesión celular observaron una mejor adhesión y supervivencia de MDPC-23. Los tratamientos previos con N-acetilcisteína (NAC) y catalasa anularon estas respuestas. Los inmunoensayos observaron la expresión aguas abajo inducida por redox de un receptor de laminina, la proteína ribosomal SA, después de RFGDT. Por lo tanto, el redox inducido por RFGDT es mediador antimicrobiano y mejora las respuestas celulares como la adhesión y la proliferación. Estas observaciones juntas proporcionan una justificación mecanicista de la utilidad clínica de RFGDT con biomateriales dentales para aplicaciones clínicas regenerativas.

Los biomateriales han permitido que la ingeniería de tejidos evolucione desde una ciencia emergente hasta su papel fundamental actual como punta de lanza de la medicina regenerativa clínica1,2,3. Estos sistemas de biomateriales se han adoptado fácilmente en diversos campos clínicos para reemplazos estéticos y funcionales. Ha habido un enorme progreso en los sistemas de biomateriales, desde portadores pasivos y biocompatibles o reemplazos inertes hasta los actuales sistemas bioactivos o inteligentes capaces de detectar y responder4,5. Los avances en estos campos han abarcado composiciones más nuevas, características nanotopológicas optimizadas, sistemas de biomateriales activados biofísicamente y de liberación controlada, entre muchos otros. Estos avances están íntimamente ligados al progreso en el desarrollo y la biología de las células madre, lo que permite una comprensión crítica de la regulación celular durante la curación y regeneración de los tejidos6,7,8. Estos incluyen regulación intrínseca con factores transcripcionales clave, organización genética, señalización, metabolómica y regulación extrínseca con membrana, interacción de ligandos a nanoescala y señalización paracrina. Además, entre estos factores extrínsecos, ahora se comprende mejor el papel de la metagenómica de la microbiota omnipresente, lo que enfatiza aún más la necesidad de una desinfección eficaz9,10,11,12,13.

La cavidad bucal presenta varios desafíos únicos con sus constituyentes biológicos de tejidos blandos y duros. Estos tejidos bucales representan un nicho anatómico exclusivo donde el tejido duro (dientes) queda expuesto a través del tejido blando (encía) a través de una interfaz delicada pero rigurosa. Se ha establecido bien la importancia de un microbioma bucal saludable y el impacto de la disbiosis en la salud bucal y sistémica14,15,16. Estos aspectos presentan desafíos importantes para los reemplazos de biomateriales debido al constante asalto biomecánico, microbiológico y vigilancia inmunológica en el entorno bucal. La combinación de estrés físico, enzimas microbiológicas y derivadas del huésped, infecciones y subproductos de la degradación pueden contribuir de forma sinérgica al fallo del biomaterial17,18. No obstante, la odontología ha utilizado de manera muy eficaz la cerámica, el metal, los polímeros y sus combinaciones como restauraciones, prótesis o implantes que son parte integral de la atención clínica actual. Las tecnologías recientes, como las impresiones digitales, la tomografía computarizada de haz cónico (CBCT) de alta resolución y la impresión 3D sustractiva y aditiva, han acelerado la sofisticación en el diseño de dispositivos y han reducido los plazos de producción, lo que permite la fabricación en el consultorio19. Estos avances con dispositivos de biomateriales fabricados a medida enfatizan aún más la necesidad de explorar técnicas prácticas de desinfección en el consultorio.

Un enfoque ideal debe proporcionar desinfección inmediatamente antes del uso clínico y no socavar el rendimiento físico o químico del material mientras se prepara de manera óptima la interfaz del biomaterial para promover respuestas biológicas favorables del huésped20,21. Se han empleado varios enfoques de desinfección, desde calor seco y húmedo, desinfección química y medios biofísicos como ultravioleta, gas dióxido de etileno, dióxido de carbono, ultrasonido, plasma y microondas22,23. Debido a las características de sus dispositivos, varias de estas fuentes efectivas de desinfección están restringidas a la producción comercial y no son prácticas para el uso clínico de rutina. La generación de plasma por descarga luminosa resulta de la ionización de moléculas gaseosas denominada avalancha o descarga de Townsend24,25. Este proceso puede facilitarse a presiones atmosféricas y bajas, lo que da como resultado un proceso no térmico que altera mínimamente las superficies objetivo. Se han utilizado varias fuentes de energía para generar plasma de descarga luminosa, como corriente continua, resonancia de ciclotrón de electrones y radiofrecuencia. Entre ellos, el tratamiento con descarga luminosa por radiofrecuencia (RFGDT) es capaz de generar un gran volumen de plasma cargado uniformemente que puede fluir a través de biomateriales tanto conductores (metales) como no conductores (polímeros)26,27. El plasma generado por RFGDT, en presencia de aire u oxígeno, elimina contaminantes orgánicos generando especies de oxígeno (ROS) altamente reactivas que promueven la oxidación y la hidroxilación de la superficie28. También se ha observado que RFGDT crea una alta energía superficial que aumenta la hidrofilicidad, facilitando la propagación y unión de las células27,29,30. Sin embargo, no se ha dilucidado el mecanismo preciso que media en esta adhesión celular mejorada después de RFGDT. Este estudio investigó los efectos de RFGDT en diferentes superficies de biomateriales dentales. Se evaluaron los efectos concurrentes sobre la desinfección de cuatro microbios orales comunes y los cambios concurrentes en la adhesión y proliferación celular en una línea celular oral, MDPC-23. Por último, los ensayos bioquímicos y moleculares investigaron el mecanismo biológico preciso que media las respuestas celulares.

El plasma generado por RFGDT afecta la química de la superficie de los biomateriales en función de su composición y la presencia de gases exógenos. A medida que la pulpa dental está expuesta a diversos biomateriales restauradores, como cemento de ionómero de vidrio, polímeros y metales, examinamos la generación de especies redox después de RFGDT con un ensayo de quimioluminiscencia con luminol31. RFGDT generó un aumento significativo en ROS de las superficies de vidrio (Fig. 1a) y platino (Fig. 1b), mientras que se observó una expresión mínima en una superficie polimérica (Polimetilmetacrilato, PMMA) (Fig. 1c). RFGDT indujo un aumento dependiente de la dosis en la generación redox con un óptimo observado a 180 s (Fig. 1d). Como un estudio anterior utilizó varios tratamientos de superficie, como detergente, alcohol o silano, observamos que solo RFGDT genera redox (Fig. 1e)27. Estos resultados muestran que, si bien múltiples agentes pueden desinfectar las interfaces de biomateriales, la inducción redox inducida por RFGDT podría prevenir de manera persistente la colonización microbiana al tiempo que modula favorablemente las interacciones de la célula huésped.

RFGDT genera redox a partir de superficies de biomateriales. La generación de ROS se evaluó con el ensayo de quimioluminiscencia Luminol inmediatamente después de RFGDT con varios biomateriales, a saber (a) vidrio, (b) metal y (c) polímero; (d) También se evaluó la generación de ROS después de diferentes tiempos de tratamiento con RFGDT; (e) Las superficies de vidrio pretratadas con ODS, alcohol o RFGDT se evaluaron con el ensayo Luminol.

Para examinar el potencial de desinfección de RFGDT, primero examinamos el antioxidante endógeno incubando microbios individuales con peróxido de hidrógeno. Notamos que Streptococcus gordonni y los mutantes de Streptococcus, que son catalasa negativos, no lograron generar efervescencia (Fig. 2a). Por el contrario, Moraxella catarrhalis y Porphyromonas gingivalis, que son catalasa positivas, generaron una efervescencia profusa que indica las capacidades activas de neutralización de ROS. Se sembraron cubreobjetos de vidrio sometidos a RFGDT con S. mutante y demostraron una viabilidad reducida con el ensayo de muertos vivos (Fig. 2b). De acuerdo con esta observación, las unidades formadoras de colonias (UFC) de S. mutantes (Fig. 2c) y S. gordonni (Fig. 2d) se redujeron significativamente después de RFGDT. La reducción de la supervivencia microbiana podría prevenirse mediante la preincubación con captadores de ROS, N-acetilcisteína (NAC) y catalasa. De acuerdo con estas observaciones, no se observaron diferencias en las UFC con M. catarrhalis (Fig. 2e) y P. gingivalis (Fig. 2f) sembradas en cubreobjetos de vidrio después de RFGDT. Estos resultados demuestran que el redox inducido por RFGDT reduce la viabilidad y la proliferación de microbios susceptibles (catalasa negativos), mientras que las especies anaeróbicas positivas a catalasa fueron resistentes.

Efectos antimicrobianos de RFGDT. (a) Se sometieron cuatro especies bacterianas a peróxido de hidrógeno y se evaluó la efervescencia; (b) la prueba de viabilidad bacteriana con ensayo TTC se realizó con S. mutans después de RFGDT. Se realizaron ensayos de formación de colonias con cuatro especies bacterianas siguiendo RFGDT, a saber (c) mutantes de Streptococcus, (d) Streptococcus gordonni, (e) Moraxella catarrhalis (f) Porphyromonas gingivalis. En algunos casos, se realizó una incubación con N-acetil cisteína o catalasa, seguida de RFGDT. norte = 3, *p < 0,05. RFGDT: Tratamiento de descarga luminosa por radiofrecuencia; NAC: N acetilcisteína; UFC: Unidades formadoras de colonias.

La adhesión celular al sustrato es crucial para la unión y posterior proliferación. Varios biomateriales, como los cementos y composites dentales, incluyen vidrio o metales que entran en contacto directo con las células de la pulpa dental. Por lo tanto, a continuación examinamos los efectos de RFGDT en una línea celular preodontoblasta de mamífero, MDPC-23. Los cubreobjetos de vidrio se sometieron a detergente, alcohol, silano (ODS) o RFGDT antes de la siembra. Examinamos las adherencias celulares tanto débiles como fuertes mediante la evaluación de poblaciones de células flotantes y adherentes inducidas por fuerza basal y centrífuga a las 5 y 24 h después de la siembra celular. Observamos un número máximo de células adherentes en el tratamiento con RFGD, mientras que la mayoría de las células en ODS y superficies tratadas con alcohol no eran adherentes (Fig. 3a, b). El análisis del curso del tiempo después de 5 y 24 h con los ensayos de fuerza de adhesión validó aún más esta observación con superficies tratadas con silano y alcohol, demostrando la mayoría de las células no adherentes en contraste con RFGDT que ofrecía una interfaz de biomaterial óptima para una adhesión celular predominantemente fuerte (Fig. 3c -mi). El pronunciado aumento de células no adherentes en el grupo tratado con alcohol a las 5 h podría atribuirse a un agente residual persistente que reduce la viabilidad celular. Finalmente, se observó que la incubación con N-acetilcisteína o catalasa reduce específicamente la unión celular mejorada por RFGDT (Fig. 3f). Estos resultados sugieren que la adhesión celular mejorada después de RFGDT está mediada por señalización mediada por redox.

Adhesión celular tras RFGDT. (a) Se sembraron células MDPC-23 en estas superficies y se evaluaron con microscopía; (b) Las células adherentes a diversas superficies de biomateriales tratados se evaluaron mediante recuento celular; (c) Las superficies sembradas de células se sometieron a fuerzas centrífugas bajas (2400 rpm) para determinar adherencias celulares débiles a las 5 h; (d) Las superficies sembradas de células se sometieron a fuerzas centrífugas altas (4000 rpm) para determinar fuertes adherencias celulares a las 5 hy (e) 24 h. (f) Se evaluó la fuerte adhesión celular con superficies de vidrio pretratadas con NAC, catalasa o peróxido de hidrógeno antes de RFGDT. Todos los estudios, n = 3, *p < 0,05. RFGD: Descarga luminosa de radiofrecuencia; ODS: n-octadeciltriclorosilano; RFU: unidades de fluorescencia relativas; NAC: N Acetilcisteína.

La adhesión celular implica acciones concertadas de múltiples moléculas citoplasmáticas y de membrana celular capaces de ensamblar dinámicamente un complejo de unión31,32,33. Entre estos diversos mediadores, se ha demostrado que los receptores de laminina en la superficie celular desempeñan un papel fundamental en la mediación de las interacciones de la matriz37. La elucidación de estos complejos adhesivos también ha identificado varios mediadores de señalización aguas arriba que describen el papel de un receptor de laminina, la proteína ribosómica SA (RPSA), inducida por señalización redox34,35. Por lo tanto, para examinar los efectos de la señalización redox en la adhesión celular, las células MDPC-23 se trataron con diversas concentraciones de peróxido de hidrógeno que demostraron una mayor expresión de RPSA y fosfo-FAK397 (Fig. 4a-c). A continuación, examinamos si la adhesión celular mejorada por RFGDT podría mediarse mediante un mecanismo similar. Observamos un fuerte aumento en la expresión de fosfo-FAK397 y RPSA después de RFGDT mediante inmunotransferencia (Fig. 4d, e) e inmunofluorescencia (Fig. 4f, g). Estas respuestas fueron anuladas mediante el tratamiento previo de la superficie del biomaterial con silano o agregando NAC, lo que indica que están mediadas por redox. Finalmente, preguntamos si la mejora de la unión celular a través del receptor de laminina mejorado después de RFGDT afectaría la supervivencia y proliferación celular. Observamos una mejora significativa (n = 3, p <0,05) en el grupo RGFDT en comparación con todos los demás grupos (Fig. 4h). Estos resultados sugieren que la adhesión celular mejorada después de RFGDT podría estar mediada por la expresión inducida de RPSA.

Redox generado por RFGDT induce la expresión de RPSA. (a) Las transferencias Western para RPSA y la expresión de FAK activada se evaluaron después de tratamientos con peróxido de hidrógeno a lo largo del tiempo; (b) y (c) se muestra la cuantificación de bandas de las transferencias Western; (d) Se realizó un análisis similar después de RFGDT en superficies de vidrio. Algunas muestras se trataron previamente con ODS o NAC antes de RFGDT y la siembra celular; (e) se muestra la cuantificación de bandas de las transferencias Western; (f) La inmunofluorescencia para la expresión de RPSA se realizó en estas superficies de vidrio después de tratamientos previos o RFGDT; (g) cuantificación en cinco campos de alta potencia como medias con desviaciones estándar; (h) Las superficies de vidrio se sometieron a silano, alcohol o RFGDT y se sembraron con células MDPC-23. El número de células se evaluó con el ensayo AlamarBlue después de 24 h. norte = 3, *p < 0,05. RFGDT: Tratamiento de descarga luminosa por radiofrecuencia; ODS: n-octadeciltriclorosilanel; NAC: N acetilcisteína; DAPI: 4′,6-diamidino-2-fenilindol.

Las interfaces de biomateriales representan una frontera importante para mejorar la integración funcional y determinar los resultados terapéuticos clínicos36. Se han producido avances significativos en la composición y el diseño de biomateriales desde interfaces inertes y biocompatibles simples hasta superficies bioactivas existentes. Los sistemas de biomateriales más recientes se centran en sistemas inteligentes capaces de detectar y responder a escenarios biológicos con respuestas dirigidas. Una característica funcional importante de estas interfaces de biomateriales es promover respuestas biológicas deseables y al mismo tiempo disuadir activamente las perjudiciales de forma selectiva3. Algunas de estas últimas respuestas están dirigidas a reducir la carga microbiana (biopelículas) para prevenir una inflamación prolongada o respuestas inmunes del huésped37,38. Esto facilita las respuestas rutinarias de curación de los tejidos y puede permitir resultados clínicos regenerativos.

Este estudio utilizó microbios orales comunes y células de la pulpa dental para examinar los efectos de RFGDT en los biomateriales utilizados habitualmente en odontología clínica. La inflamación pulpar debido a la caries produce una necrosis irreversible, lo que requiere intervención endodóntica y restauraciones coronales. Varios agentes de recubrimiento pulpar, como el hidróxido de calcio, el agregado de trióxido mineral (MTA), Emdogain o el cemento de ionómero de vidrio, proporcionan señales para promover la curación del tejido (osteodentina). Sin embargo, no abordan directamente la infección residual que provoca una inflamación prolongada. Las estrategias directas de modificación de la superficie del plasma generan propiedades antibacterianas mediante la modulación de la topografía o la química de la superficie39. Además de servir como técnica de desinfección alternativa, sus efectos para mejorar las interfaces biocompatibles han sido bien documentados. Esta destacada acción dual de RFGDT observada en este estudio, a saber, desinfección antimicrobiana y promoción de la adhesión y expansión celular, es particularmente atractiva para uso clínico (Fig. 5)40,41. Las acciones antimicrobianas de RFGDT dirigidas predominantemente a los microbios catalasa negativos parecen ser directamente relevantes para escenarios clínicos saludables donde predominan las bacterias aeróbicas. La eficacia reducida sobre los microbios catalasa negativos fue evidente en este estudio y podría abordarse clínicamente con enjuagues o medicamentos adicionales antes de la colocación del material.

Esquema de las respuestas del RFGDT. La imagen muestra las acciones duales del redox generado por RFGDT con un efecto antimicrobiano sobre las bacterias orales al tiempo que induce el receptor de adhesión de laminina, RPSA facilita una mejor unión celular y la expansión de los odontoblastos.

Este estudio señaló que la generación de especies redox a partir de superficies de biomateriales se basaba en su composición química. Si bien tanto el vidrio como el platino podrían inducir redox, el sustrato polimérico (PMMA) demostró una inducción mínima. Esto parece reflejar el potencial de ionización de los componentes elementales predominantes (vidrio: sílice 786 kJ/mol y platino 867 kJ/mol) que son representativos de biomateriales dentales como el cemento reforzado y los implantes metálicos. Los cementos y composites reforzados con vidrio o metal se utilizan habitualmente como materiales de restauración dental. Un estudio anterior señaló que las restauraciones de vidrio Dicor cementadas con composites de resina mejoraban la supervivencia clínica que otros biomateriales42. Sin embargo, a diferencia del vidrio y estos dos biomateriales que interactúan íntimamente con las células, el material polimérico (PMMA: 6857 kJ/mol) se utiliza predominantemente para fabricar prótesis externas donde las características de desinfección no adhesivas son de mayor importancia. Investigaciones futuras podrían investigar las respuestas celulares al PMMA, incluidos enfoques de funcionalización para mejorar la interfaz celular. Sin embargo, los materiales compuestos directos, como los apósitos pulpares, no parecen adecuados para la técnica RFGDT.

Observamos un tiempo de tratamiento óptimo de tres minutos para la desinfección y una mejor adhesión celular con RFGDT para superficies de vidrio al vacío. Además de la composición del biomaterial y el tiempo de tratamiento, otras variables que determinan estas respuestas interfaciales incluyen la composición gaseosa (como helio o argón) dentro de la cámara, la densidad de energía y la presencia de otros agentes traza43,44. La atención a estos parámetros puede permitir el desarrollo de futuros protocolos RFGDT específicos de biomateriales. También es importante enfatizar que la RFGDT se realizó en superficies de biomateriales inanimados, antes de la siembra celular, sin exposición directa a microbios o células. Los tratamientos directos con plasma no térmico en células de mamíferos provocan daños en el ADN y pérdida de viabilidad45. Básicamente, esto implica que la RFGDT clínica directa en tejidos humanos para desinfectar o mejorar las respuestas celulares es una estrategia insostenible. No obstante, los tratamientos superficiales de los dispositivos de biomateriales podrían prepararlos para interacciones óptimas con los tejidos, como la osteointegración de implantes metálicos, ionómero de vidrio o compuestos reforzados con metal como materiales de empaste dental. Esta última aplicación fue una motivación principal en nuestra elección de la línea celular de preodontoblastos, MDPC-23. Curiosamente, hemos observado una sensibilidad redox diferencial entre células de linaje discreto en otros estudios46. Los estudios futuros podrían examinar la selectividad de RFGDT en sistemas complejos de biomateriales multipartitos con tipos de células específicos como osteoblastos (osteointegración), queratinocitos (cicatrización de heridas), fibroblastos (producción de matriz) o células endoteliales (angiogénesis) para resultados clínicos dirigidos. Este estudio observó ROS generadas por RFGDT detectadas mediante quimioluminiscencia después de la oxidación de luminol31. Las cantidades y las ROS discretas tienen funciones críticas en la supervivencia, migración y apoptosis celular47,48. Redox es un regulador fisiológico de las cascadas de señalización intracelular, especialmente los factores de crecimiento mediados por tirosina quinasa, y ha ganado atención recientemente debido a su capacidad para oxidar reversiblemente objetivos sensibles a redox49. Estas modificaciones redox reversibles de los residuos de cisteína en las proteínas, también denominadas interruptores de tiol, están reguladas por la oxidorreductasa y las tiolisomerasas50. Su función principal consiste en neutralizar el exceso de redox en el sistema biológico que puede provocar daños nocivos. Otros objetivos de la señalización generada por redox incluyen una amplia gama de componentes citoesqueléticos, intermediarios de señalización y reguladores transcripcionales.

Un hallazgo importante en este estudio es que el redox inducido por RFGDT promueve la expresión del receptor de laminina, la proteína ribosomal SA (RPSA), que contribuye a mejorar la adhesión y la supervivencia celular. Las lamininas son glicoproteínas extracelulares de alto peso molecular que constituyen el principal componente no colágeno de la lámina basal de las células51,52. Sus proteínas multidominio están codificadas por once genes humanos caracterizados por cadenas heterodiméricas α, β y γ que constituyen 16 isoformas diferentes. Sus contribuciones clave a funciones celulares como la adhesión, la migración y la diferenciación están bien descritas. Ha habido conocimientos recientes sobre las funciones de las lamininas específicas para impulsar selectivamente el enriquecimiento celular y la especificación del linaje que tiene potentes implicaciones para la curación y regeneración de tejidos53. Además de los miembros prototípicos, existen muchas proteínas con dominios similares a la laminina que incluyen RPSA, LamR, 37LRP y LBP/p40, entre otras54. La RPSA es una proteína ribosómica con varias funciones fisiopatológicas en la traducción de proteínas, la adhesión celular, la invasión de células tumorales, la entrada de células virales y la detección de moléculas pequeñas55,56. La secuencia de aminoácidos se conserva evolutivamente con más del 98% de homología en todos los mamíferos y similitudes estructurales con el gen procariótico RPS254. Sería interesante examinar la importancia funcional del RPS2 inducido por RFGDT en las especies microbianas en estudios futuros.

Se ha observado que RPSA participa en la traducción eucariótica dependiente de cap, especialmente en células transformadas e infectadas por virus. Sin embargo, la inducción ascendente de la señalización de RPSA aún no se ha dilucidado por completo. Algunos informes anteriores han señalado que RPSA es inducido por señalización generada por redox, lo que sugiere que es un gen diana inducible por redox34,35. De acuerdo con estos informes, este estudio describe la capacidad del redox inducido por RFGDT para aumentar la expresión de RPSA. La mayor expresión de este receptor de adhesión celular contribuiría a mejorar la unión y supervivencia de las células MDPC-23. Se ha observado que la agrupación de membranas de estos receptores de laminina induce la fosforilación de FAK en tirosina 397, como también se observó en este estudio. Tanto la activación de FAK como la de Src en estos complejos de adhesión a la membrana impulsan aún más funciones celulares como la propagación, migración, proliferación y prevención de la apoptosis celular. Por lo tanto, el uso de RFGDT parece evocar respuestas biológicas discretas generadas por redox que pueden aprovecharse tanto para la desinfección como para funciones celulares como la unión, expansión y diferenciación celular para ayudar a la regeneración de tejidos.

En conclusión, este estudio demuestra la capacidad de una herramienta de energía dirigida no invasiva, RFGDT, para ser capaz de realizar una desinfección antimicrobiana simultánea y mejorar las respuestas celulares dirigidas a través de señales redox. Esto muestra a RFGDT como una herramienta de mesa simple, rentable y conveniente para aplicaciones clínicas para mejorar la curación de tejidos y los resultados regenerativos.

Se mantuvieron células de pulpa dental de ratón (MDPC-23, amable obsequio de los Dres. Jacques Nor y Tatiana Botero, Universidad de Michigan) en DMEM (Glutamax, alto contenido de glucosa) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (grado certificado) y 100 unidades ml. −1 Penicilina y 100 µg mL−1 Estreptomicina (todos de Thermo-Scientific, EE. UU.). Las células se cultivaron a 37 °C en una cámara humidificada con 5% de CO2.

El cubreobjetos (18 mm, 0,12–0,17 mm de espesor, micro cubreobjetos Matsunami) se limpió primero con detergente al 10% (Sparkleen, Fisher Scientific, EE. UU.) y se sonicó (Aristocrat Ultrasonic, Healthco, EE. UU.) durante 10 minutos, seguido de tres lavados. en agua destilada y se dejó secar verticalmente en un recipiente. Después de esto, algunos cubreobjetos se empaparon en etanol al 95% (Sigma-Aldrich, EE. UU.) durante 10 minutos, mientras que otro conjunto se empapó en n-octadeciltriclorosilano (ODS) al 2% durante 10 minutos. Finalmente, se sometió otro conjunto de cubreobjetos a RFGDT, como se describe a continuación. Excepto el RFGDT, todas las muestras se esterilizaron bajo luz ultravioleta o 15 minutos antes de la siembra celular.

Se utilizó un dispositivo RFGD de vacío de aire parcial (PDC-32G, Harrick Scientific, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Los biomateriales (cubreobjetos de vidrio, láminas de platino o discos de PMMA) se colocaron dentro de la cámara y se trataron varias veces como se indica en estudios individuales. Las muestras de biomaterial se utilizaron inmediatamente para estudios bioquímicos, microbiológicos o de adhesión/supervivencia celular.

Se sembraron células MDPC-23 a una densidad celular de 1 x 105 células ml-1 en las superficies de vidrio tratadas descritas anteriormente colocadas en una placa de 12 pocillos. La viabilidad y proliferación celular se evaluaron con el ensayo AlamarBlue según las instrucciones del fabricante. Brevemente, después de 24 h de incubación celular, se añadió 10% (v/v) de reactivo AlamarBlue (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) al medio completo y se incubó durante 2 h. Se transfirieron réplicas de medios condicionados de cada pocillo a pocillos negros y se evaluó la fluorescencia utilizando un lector de placas (Victor3, Perkin Elmer, EE. UU.).

Se sembraron células MDPC-23 a una densidad celular de 1 x 105 células ml-1 en las superficies de vidrio tratadas descritas anteriormente colocadas en una placa de 12 pocillos. La adhesión celular se evaluó después de 5 h de incubación como se describió anteriormente. Como se sembraron células equivalentes en todas las condiciones de sustrato y no se espera proliferación dentro de las 5 h, se contaron las células flotantes no adherentes (números globales más altos y más confiables) en cada condición en lugar de obtener imágenes de múltiples campos de alta potencia (menores, menos). números locales confiables) por pozo. Se recogieron los medios de cada pocillo, se tiñeron con azul tripán (0,4 % p/v, Sigma-Aldrich, EE. UU.) y se evaluaron las células flotantes (no sembradas). Después de reemplazar los medios, las placas se sometieron a centrifugación (Eppendorf, EE. UU.) a 2400 rpm (adherencias débiles) y 4000 rpm (adherencias fuertes) durante 6 minutos, y los medios se recogieron para evaluar el número de células. También se capturaron imágenes de estos pocillos antes y después del centrifugado para documentar el número y la morfología de las poblaciones de células adherentes. En algunos estudios, se incluyeron catalasa (10 uM), N-acetilcisteína (1 mM) o peróxido de hidrógeno (todos de Sigma-Aldrich, EE. UU.) en los medios antes de la siembra celular de las superficies de vidrio para evaluar el papel de RFGDT. -ROS inducidas en la mediación de la adhesión celular.

Para evaluar las ROS generadas por RFGDT, se utilizó un ensayo de quimioluminiscencia con Luminol (detecta ROS tanto extra como intracelulares) como se describió anteriormente33. Brevemente, se preparó una solución mezclando 5 mg de luminol en polvo con 100 ml de hidróxido de sodio 1 M (ambos Sigma-Aldrich, EE. UU.) y se mezcló suavemente. La solución de luminol recién preparada se añadió a las células en una placa de 12 pocillos en una proporción de 1 ml/pocillo (v/v) inmediatamente después de los tratamientos con RFGDT en diferentes dosis, y se detectó quimioluminiscencia a los 0,5, 1, 3 y 5 min. utilizando un detector multipocillo (Victor3, Perkin Elmer, EE. UU.).

Los cubreobjetos de vidrio se trataron con RFGDT y se sembraron con células MDPC23. Después de 5 h de incubación en una incubadora de CO2, las células adheridas al cubreobjetos se recogieron de diferentes grupos y las células recolectadas se resuspendieron en tampón RIPA (Sigma-Aldrich, EE. UU.) con Mini inhibidor de proteasa (Thermo Scientific, EE. UU.). Las células se perturbaron con dos ciclos de sonicación (QSonica, EE. UU.) durante 5 s cada uno, y los lisados se centrifugaron a 14.000 rpm a 4 °C durante 20 min. La proteína total en los lisados se cuantificó con el kit de ensayo Bradford (BCA Protein Assay, Thermo Scientific Inc). Los lisados de proteínas se separaron en geles prefabricados sin tinciones TGX de miniproteínas y se transfirieron a membranas de PVDF (ambas de Bio-Rad, EE. UU.). Las transferencias se bloquearon inicialmente con BSA al 1% durante 1 h y se incubaron adicionalmente con anticuerpos primarios para la proteína ribosómica SA (RPSA, Abcam, EE. UU.) o fosfo-FAK (señalización celular, EE. UU.) a 4 ° C durante la noche. Después de los lavados, las transferencias se incubaron para la normalización con anticuerpos secundarios conjugados con HRP específicos de cada especie (señalización celular, EE. UU.) o β-actina conjugada con HRP (señalización celular, EE. UU.). Finalmente, las transferencias se revelaron utilizando sustratos quimioluminiscentes (Thermo Scientific, EE. UU.) y las imágenes se escanearon digitalmente utilizando ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad Laboratories, EE. UU.). Las intensidades de las bandas de proteínas de las transferencias Western se cuantificaron utilizando el software ImageJ. En las figuras de apoyo se proporcionan múltiples exposiciones de transferencias.

En todos los grupos, se llevaron a cabo experimentos de inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo de laminina primaria (RPSA) (Cat # ab133645, Abcam, EE. UU.) y el anticuerpo secundario Alexa fluor 488 (Cat # 4412S, Cell signaling, EE. UU.), las imágenes se capturaron usando ZOE Fluorescent Cell. Imager (Bio-rad, EE. UU.), donde el núcleo se contratiñó con DAPI. Se capturaron imágenes digitales y, tras establecer un umbral, se cuantificó la intensidad de la fluorescencia en todo el campo utilizando el software NIH ImageJ como se describió anteriormente57,58.

Se cultivaron anaerobios facultativos como Streptococcus mutantes (S. mutants), Streptococcus gordonii DL1 (S. Gordonni), Moraxella catarrhalis (M. catarrhalis) en medio de infusión cerebro-corazón (BD Bioscience, EE. UU.) a 37 ℃ y anaerobio obligado Porphyromonas gingivalis ( P. gingivalis) se cultivó anaeróbicamente en medio caldo de soja tripticasa (BD Bioscience, EE. UU.) suplementado con 10% de sangre de oveja, hemina (5 μg mL-1) y menadiona (1 μg mL-1) y se incubó a 37 °C en un atmósfera de N2/H2/CO2 (90:5:5). Se añadió una sola colonia de cada bacteria a 5% o 15% de H2O2 y se analizó cualitativamente la presencia de catalasa antioxidante. Para el ensayo de supervivencia, se añadió una solución de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio al 10% (TTC, Sigma Aldrich, EE. UU.) a los pocillos de cultivo y se incubó durante 6 a 12 h o hasta que se hizo evidente el cambio de color rojo. La intensidad del color se cuantificó utilizando un lector de microplacas (SpectraMax i3x, Molecular device, EE. UU.) a 480 nm.

Para los ensayos de UFC, se inocularon cubreobjetos con 250 uL de cultivo bacteriano respectivo y se incubaron en condiciones de crecimiento específicas de cada especie durante 24 h (S. gordonni, M. catarrhalis, S. mutantes) o 5 días (P. gingivalis). Se diluyeron en serie alícuotas de cultivo bacteriano de cubreobjetos de vidrio mediante diluciones diez veces mayores y se sembraron mediante la técnica de placa de gota.

Los datos se analizaron utilizando Excel (Microsoft, EE. UU.) y la significación estadística se evaluó mediante ANOVA unidireccional o pruebas t, donde p <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los estudios se repitieron al menos dos veces y cada ensayo se realizó en duplicados mínimos.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios. Sin embargo, cualquier información o material adicional está disponible de los autores previa solicitud razonable.

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Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por una subvención de inicio de facultad (PRA). Este manuscrito está dedicado a la memoria del Dr. Robert E Baier.

Estos autores contribuyeron igualmente: Sasikumar Ponnusamy y Hanan H. Ali.

Robert E. Baier ha fallecido.

Departamento de Biología Oral, Cirugía e Ingeniería Biomédica, Universidad de Buffalo, 3435 Main Street, B36A Foster Hall, Buffalo, NY, 14214, EE. UU.

Sasikumar Ponnusamy, Hanan H. Ali, Felisha Dutt, Saeed Ur Rahman, Ahmad A. Salah, Mahek Pipalia y Praveen R. Arany

Departamento de Biomateriales, Universidad de Buffalo, Buffalo, Nueva York, EE. UU.

Robert E. Baier

Biología Oral, Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Universidad Médica Khyber, Peshawar, 25000, Pakistán

Saeed Ur Rahman

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SP y HA realizaron estudios y prepararon el borrador principal del manuscrito, FD, SR, MP y AS ayudaron con varios estudios y recopilación de datos; RB proporcionó aportes con el diseño inicial del estudio y PA supervisó el proyecto y revisó el manuscrito.

Correspondencia a Praveen R. Arany.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Ponnusamy, S., Ali, HH, Dutt, F. et al. La señalización redox induce la expresión de la proteína SA ribosómica del receptor de laminina para mejorar la adhesión celular después de tratamientos de descarga luminosa por radiofrecuencia. Informe científico 12, 7742 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11766-9

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Recibido: 19 de enero de 2022

Aceptado: 20 de abril de 2022

Publicado: 11 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11766-9

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